Первый медицинский портал рунета
Пользователям сайта
Статистика
Яндекс.Метрика

Радиоиммунный анализ основан на иммунных реакциях с использованием меченых соединений. Он отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Термин «радиоиммунный анализ» очень часто используется для обозначения всех in vitro методов, в которых применяются меченые соединения. Корректнее, на наш взгляд, использовать более универсальный и строгий термин — «радиолигандный анализ».

Существует несколько типов радиолигандного анализа: радиоиммунный анализ (РИА); иммунора- дио-метрический анализ (ИРМА); конкурентное белковое связывание (КБС); радиорецепторный и радио- энзиматический.

Радиолигандный метод используется как для количественного, так и для качественного анализа. Если первоначально он находил применение только для определения некоторых природных полипептидных гормонов, то в настоящее время с помощью этого метода определяется весьма большое количество биологически активных соединений различной природы (гормоны, ферменты, маркеры миокардиального повреждения и др.).

Радиоиммунный анализ был впервые разработан Berson Yalow (1960) для определения уровня эндогенного инсулина в плазме крови человека. Метод основан на конкуренции определяемого вещества со своим меченым аналогом за ограниченное число мест связывания у высокоспецифичных антител. В тест- системе радиоактивный лиганд связывается со специфическими антителами к немеченому лиганду, в результате чего образуется комплекс «меченый лиганд — антитело». Определяемый гормон (лиганд) плазмы крови конкурирует с меченым аналогом за связывающие места антитела и тем самым снижает взаимодействие последнего с меткой. Вследствие этого соотношение концентраций свободного и связанного с антителом лигандов уменьшается. Связанную и свободную формы меченого соединения разделяют одним из известных способов (адсорбция, фракционное осаждение, метод двойных антител и т.д.).

Заключительными этапами РИА являются радиометрия одной из фракций, построение калибровочной кривой, отражающей динамику изменений радиоактивности связанного (или свободного) лиган- да в зависимости от количества внесенного в пробирку немеченого аналога (стандарта). Концентрация гормона в анализируемом образце устанавливается путем сравнения радиоактивности этого образца с уровнем счета в стандартных пробах и перенесения полученного значения на калибровочную кривую.

К преимуществам РИА относятся: высокая чувствительность — способность выявлять минимальные количества вещества; специфичность — измерение количества только одного строго определенного вещества; точность — определение истинного количества вещества; воспроизводимость — возможность повторения результатов в одной пробе при анализе наборами из разных партий.

Недостатками РИА считаются: недолговечность хранения меченого лиганда по причине физического распада метки, ее отщепления и радиолиза носителя; разрушение лиганда при йодировании; необходимость высокой очистки лиганда; недостаточная чувствительность при низком содержании определяемого вещества в биологических жидкостях; низкая специфичность, обусловленная неселективным связыванием меченого соединения компонентами плазмы крови; необходимость предварительной экстракции определяемого лиганда в тех случаях, когда он связан с белками или липопротеидами плазмы, а также при наличии в крови веществ, обладающих перекрестной иммуно-реактивностью по отношению к определяемому лиганду.

Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, РИА в настоящее время является самым распространенным методом радиолигандного анализа.

Иммунорадиометрический метод основан на использовании меченых высокоспецифичных антител. При ИРМА происходит разделение не свободного и связанного лиганда, а свободного и связанного антитела. При этом количество антител используется с избытком по отношению к лиганду. Обычно ход реакции следующий: в пробирку с определяемым гормоном вносят избыток меченых антител, инкубируют образец, после чего свободные антитела отделяют с помощью сефарозы, содержащей ковалентно связанный гормон, и удаляют центрифугированием. Радиоактивность полученного супернатанта прямо пропорционально отражает содержание определяемого гормона.

ИРМА обладает рядом преимуществ по сравнению с РИА:

1) позволяет избежать влияния таких факторов, как неспецифическое связывание, поэтому является более точным и не требует предварительной экстракции проб;

2) разновидность ИРМА — метод двойного связывания — обладает более высокой чувствительностью за счет возможности проводить экстракцию определяемого вещества из относительно большого объема жидкости;

3) лиганд не йодируется, поэтому нет опасности его повреждения при обработке;

4) может быть использован для анализа веществ, с трудом поддающихся йодированию (например, циклические нуклеотиды, пептиды, лишенные ти- розиновых остатков);

5) меченые антитела менее подвержены радиолизу, чем меченые лиганды.

Наряду с преимуществами для ИРМА характерны следующие недостатки:

1) является довольно дорогостоящим, таккактребует очистки высокоспецифичных антител и приготовления иммобилизованных антигенов или антител на сефарозе;

2) не годится для систем, в которых комплекс «ан- тиген-антитело» обладает высокой константой диссоциации, поскольку добавление избытка иммобилизованных лигандов в конце периода инкубации может нарушить равновесие первичной реакции «антиген-антитело».

В связи с высокой стоимостью используемых реактивов иммунорадиометрический метод не получил широкого распространения.

Конкурентное белковое связывание является методом, основанным на использовании вместо антител естественных белков плазмы или тканей, которые обладают специфическим сродством к гормону или классу гормонов (например, транскортин при определении кортизола).

Основное преимущество метода КБС — дешевизна, так как исходный материал, используемый для выделения связывающих белков, недорог и доступен.

Основные недостатки метода КБС:

1) низкая по сравнению с РИА чувствительность, так как связывающие белки обычно имеют более низкое сродство к лигандам, чем антитела;

2) низкая специфичность связывающих белков, которые обычно связывают группу близкородственных гормонов — например, тироксинсвязывающий глобулин образует комплексы с тироксином и трийодтиронином; 3) константа сродства связывающих белков сильно зависит от температурного режима, поэтому анализ приходится проводить при низкой температуре в условиях ее строгого контроля. В связи с вышеперечисленными недостатками метод КБС не нашел широкого распространения и применяется в основном для определения кортизола и цАМФ.

Радиорецепторный анализ является методом, основанным на использовании клеточных рецепторов к гормонам и биологически активным веществам в качестве связывающих агентов. Радиорецепторный анализ отличается более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими методами радиолигандного анализа. Обычно при радиорецеп- торном анализе используются рецепторы, выделенные из плазматических мембран органов-мишеней, которые в химическом отношении представляют собой липопротеидный комплекс. Особое положение занимает определение цАМФ с помощью связывающего белка из скелетных мышц, так как этот метод можно отнести как к радиорецепторному анализу, так и к методу КБС.

Недостатки радиорецепторного метода:

1) его можно использовать только для анализа тех соединений, к которым существуют клеточные рецепторы;

2) сложная методика выделения рецепторов приводит к значительным различиям между препаратами, что затрудняет стандартизацию метода;

3) рецепторы нестойки при хранении.

По причине вышеперечисленных недостатков метод не получил широкого распространения в клинике, хотя в экспериментальных исследованиях применяется достаточно широко.

Радиоэнзиматический анализ отличается от всех вышеописанных радиолигандных методов тем, что в его основе лежит не комплексообразование определяемого лиганда с антителом или другим связывающим агентом, а ферментативное расщепление меченого субстрата с переносом радиоактивных фрагментов последнего на конечные продукты реакции. Предшественниками этих продуктов и являются определяемые вещества. Остается лишь хроматографичес- ки разделить их и радиометрировать с последующим пересчетом по калибровочной кривой.

Преимуществом радиоэнзиматического метода является то, что его можно использовать в тех случаях, когда получение антител к определяемому лиган- ду затруднено или определяемый лиганд быстро разрушается при инкубации.

Недостатки радиоэнзиматического метода:

- относительная техническая сложность;

- более низкая, по сравнению с РИА, чувствительность.

В связи с вышеперечисленными недостатками метод не нашел широкого распространения в клинике.

Математическая обработка полученных результатов и построение калибровочной кривой. Пересчет результатов радиометрии проб в единицы концентрации или активности производится методом построения калибровочной кривой, для чего используются стандарты с известным количеством немеченого соединения. По мере увеличения концентрации лиганда в стандарте количество радиоактивных комплексов уменьшается и, следовательно, снижается радиоактивность получаемого осадка. Наибольшей радиоактивностью обладает осадок в пробирках, не содержащих немеченого антигена, так называемый нулевой стандарт, который обозначается как Во. Радиоактивность осадка в пробирках со стандартами обозначают как В. При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают процент связывания метки — отношение (В/Во)-100%. Обычно используется пять или шесть стандартов, по мере увеличения концентрации лиганда в которых В/Во уменьшается.

В некоторых РИА-наборах осаждается не комплекс «антиген-антитело», а свободный лиганд с помощью’активированного угля — например, наборы для определения простагландинов. В этих наборах определяется радиоактивность не осадка, а надосадоч- ной жидкости, поэтому при построении калибровочной кривой процент связывания повышается по мере увеличения концентрации стандартов. Помимо нулевого стандарта и стандартов гормона используются еще две пробы: а) тотальная проба (Т), которая содержит только метку и характеризует ее активность; б) проба на неспецифическое связывание (НСВ), содержащая все компоненты РИА-набора кроме антитела и позволяющая определить неспецифическое связывание метки разделяющими компонентами и стенками пробирки.

Неспецифическим связыванием определяемого гормона очень часто обладает сама сыворотка. Если процент неспецифического связывания, определенный как отношение (НСВо/Т) -100% или (НСВ/Т) 100%, не превышает 5, то его можно не учитывать, если же он в неизвестных пробах больше 5, то его нужно вычислять для каждой пробы или проводить экстракцию гормона из плазмы крови для уменьшения процента неспецифического связывания, как это делается для вазопрессина, циклических нуклеотидов, соматостатина, простагландинов и ряда других гормонов и биологически активных веществ.

Стандартная кривая может быть построена несколькими способами, однако во всех случаях по оси ординат откладывается процент связывания, а по оси абсцисс — концентрации стандартов. Существуют четыре основных способа построения калибровочной кривой.

1. Построение эмпирического графика с использованием линейной шкалы координат. Для этого по оси ординат откладывают процент связывания (В/Во)- 100% или (В/Т) • 100% по оси абсцисс — концентрации стандартов. В этом случае полученный график имеет вид экспоненциальной кривой. Очень часто используется система координат, В которой ось ординат является линейной шкалой, а на оси абсцисс представлены десятичные логарифмы значений В/Во. В этом случае кривая имеет сигмоидальный характер. Все фирмы, выпускающие наборы, в руководствах к этим наборам прилагают рисунки с готовым графиком, характерным для данного набора. Эти графики позволяют проверить качество выполнения калибровочной кривой. Как правило, полного совпадения не бывает. Обычно полученный график при аккуратном выполнении анализа располагается параллельно, но несколько ниже «фирменной» кривой. Такое «снижение» кривой связано со «старением» набора от момента выпуска до момента его реализации.

2. Логит-лог преобразование, производимое с целью трансформировать сигмоидальную кривую в прямую линию. Задачей такого выпрямления является построение как можно более верной калибровочной кривой, что позволило бы точнее определить концентрацию гормона в неизвестных пробах. Формула трансформации отношения В/Во в соответствующий логарифм:

(В/Во)=В/(Во-В).

По оси ординат откладывают натуральный логарифм В/Во, а по оси абсцисс — десятичный логарифм концентрации стандартов.

В результате логит-лог преобразования прежде всего происходит «выпрямление» краевых сигмои- дальных участков, что позволяет расширить область статистически достоверных измерений.

3.Метод наименьших квадратов. Как уже отмечалось выше, задачей логит-лог преобразования является построение калибровочной кривой, максимально приближенной к истинной стандартной кривой. Однако сделать это точно «на глазок» невозможно, поэтому применяется метод математической обработки, получивший название метода наименьших квадратов (МНК). Этот метод позволяет с помощью компьютера построить статистически усредненную прямую линию, максимально отражающую расположение всех точек калибровочной кривой.

Суть МНК состоит в минимизации средне-квадратичного отклонения аппроксимирующего значения функции от измеренного значения в данной точке на всем протяжении сглаживающей кривой. Практически МНК применим для сглаживания логит-лог преобразованных прямых следующим образом. Если в результате радиометрии и логит-лог преобразования получен набор точек (xi, yi), где xi — натуральный логарифм стандартной дозы; yi=logit(B/Bo)i, то, предполагая минимальным квадрат отклонения, можно получить уравнение линейной зависимости у от х-вида